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갈락토오스 및 갈2의 Phe504 돌연변이체를 발현하는 세포의 포도당 수송 활동. 도 3에 기재된 바와 같이 0.1 mm 갈락토오스(solid bar) 또는 0.1 mm 글루코스(hatched bar)의 수송을 야생형 Gal2 또는 19개의 상이한 Phe504 돌연변이체 각각을 발현하는 LBY416 세포에서 측정하였다. 변형된 녹색 형광 단백질(F64L,S65T 변이체),pEGFP(카탈로그 번호 6077-1, CLONTECH, CA)에 대한 유전자를 함유하는 플라스미드를 융합 단백질을 만들기 위해 사용되었다. 4개의 뉴클레오티드, ATGG, NcoI 부위를 개방 판독 프레임의 외부로 이동시키기 위해 EGFP의 개시 코돈에 위치한 NcoI 부위에 삽입되었다. ClaI 사이트는 TAAAGCGG를 TAATCGAT로 변경하여 EGFP의 종료 코돈의 바로 하류에 만들어졌습니다. GAL2D-pTV3es의 NcoI 사이트의 순서는 CCTTGG로 변경되었으며, 새로운 NcoI 사이트는 CCATGG를 추가하여 GAL2의 종료 코돈의 바로 상류에 만들어졌습니다. EGFP는 NcoI 및 ClaI로 절단하고 GAL2D-pTV3es에서 GAL2의 COOH 종점에 결찰하여 pGAL2-GFP를 얻었다. 그 결과, pGAL2-GFP는 GAL2의 말단에 NcoI 부위를 가지며, 두 아미노산인 Pro-Trp에 대한 코딩 서열이 경계에 삽입되었다. GFP 태그가 달린 야생형 Gal2의 갈락토오스 수송 활성은 태그가 지정되지 않은 Gal2(93±7.5%, 평균 ±S.E.,n=5)와 크게 다르지 않았다. GFP 태그 Gal2 돌연변이를 만들기 위해, 돌연변이GAL2는 Tyr352 돌연변이체에 대한 EcoRI 및 MluI또는 Phe504 돌연변이체에 대한 EcoRI 및 StuI로 잘라내고, 그 pGAL2-GFP의 해당 부분을 대체했다. GFP로 태그된 Gal2의 Phe504 돌연변이체의 국소화.

각각의 GFP 태그가 지정된 Phe504 돌연변이를 코딩하는 플라스미드를 항하는 LBY416 세포는 도 7 및 “실험 절차”에 기재된 바와 같이 상 및 형광 영상을 로그화하여 배양하였다. 초기 지수 내지 중간집식 상에서 살아있는 세포는 필터 큐브 L5를 구비한 에피플루오레스 현미경(DMR, 라이카)으로 조사하였다. 현미경 사진은 필름 (T-MAX p3200, 코닥)에 기록되고 어도비 포토샵과 캔버스 (데네바 소프트웨어)와 함께 디스플레이를 위해 처리되었다. 개별 세포의 형광 강도가 이전에 언급된 바와 같이 이질적인 것으로 관찰되었다(18, 19), 대표적인 세포는 여기에 도면에서 도시되어 있다. 대조군으로서, ANS6-2D(MATα sec6-4 ura3-52 leu2-3, 112 trp1-289 his3/4)를 사용하여 Gal2-GFP가 혈장 막에 국한되어 있는지 확인하였다. 제한 온도에서, sec6 세포의 분비 소포는 세포질 (20)에 축적된다. 23개의 아로마 아미노산의 백분율은 63개의 설탕 수송기 및 설탕 수송기 관련 단백질의 아로마 부위를 보존했습니다. DOMO 데이터 베이스(DM00135)(15)에서 63개의 관련 단백질을 정렬하여 단백질의 50%에 방향족 아미노산을 함유하는 23개의 부위를 밝혀냈습니다. 이러한 아미노산 (단일 문자 코드에 표시) 그리고 그들의 위치는 Gal2에 대 한 표시 됩니다. 23개 부위각각에서 방향족 아미노산을 함유하는 단백질의 수를 백분율로 발현하였다. 63개의 단백질 중 75%에 방향족 아미노산을 함유한 14개의 부위가 추가 분석을 위해 선택되었습니다. 다운로드 : 고해상도 이미지 다운로드 (227KB)다운로드 : 다운로드 전체 크기 이미지 우리는 이전에 넣어 TM10에 두 방향족 아미노산이 효모 수송 Gal2 및 Hxt2 (8, 9)뿐만 아니라 포유류 수송 Glut1 (10)에서뿐만 아니라 설탕 수송에 중요하다는 것을 보여 주었다.

이 3개의 단백질은 포유류 조직의 수동 적인 설탕 수송및 더 높은 식물, 녹색 조류, 원생 동물, 효모, 시아노박테리아 및 eubacteria (21-24)에서 수동 적인 또는 활성 설탕/H+ 수송기를 포함하는 Glut 가족에 속합니다. Glut 가족의 구성원에 의해 설탕 수송에 있는 방향족 아미노산의 추가 역할을 조사하기 위하여는, 우리는 DOMO 데이터 베이스에 있는 설탕 수송기 및 관련 단백질 사이에서 보존되는 방향족 사이트를 검색했습니다.